In vitro Systeme mit Hepatozyten

Besonders in Folge der neuen europäischen Chemikaliengesetzgebung REACH ist der Bedarf an schnelleren und aussagekräftigeren toxikologischen Testmethoden enorm gestiegen. Eine besondere Bedeutung kommt hierbei Hepatozyten zu, weil dieser Zelltyp der Leber bei der Giftung bzw. Entgiftung einer Vielzahl von Fremdstoffen eine zentrale Rolle spielt. Allerdings ist es schwierig, Hepatozyten nach Isolierung aus dem Lebergewebe in Kultur zu nehmen. Denn diese können in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen ihre Eigenschaften massiv ändern. Unsere Projektgruppe hat entscheidende Faktoren des „early signaling“ identifiziert, welche für diese Unterschiede verantwortlich sind und Möglichkeiten der Manipulation entwickelt, welche es ermöglichen, dass die Eigenschaften von Hepatozyten in vitro der in vivo Situation sehr nahe kommen (Godoy et al., 2009). Dies eröffnet neue Möglichkeiten, in vitro Systeme mit Hepatozyten auch im Rahmen toxikologischer „-omics“-Klassifikationsstudien einzusetzen, was zur Zeit im Rahmen von EU und BMBF-Projekten bearbeitet wird.

Abb. 1: Hepatozyten in vivo und in vitro. A. Rekonstruktion von Lebergewebe aus konfokalen Laserscans. Die Rekonstruktion zeigt, wie Sinusoide und Gallenkanalikuli ineinander verwoben sind (Färbung mit DPPIV und DAPI). B. Hepatozyten in vitro in einem optimierten dreidimensionalen in vitro System, in welchem sie in Kompenenten der extrazellulären Matrix der Leber eingebettet vorliegen. In diesem Kultursystem bilden sich ebenfalls Gallenkanalikuli aus, welche durch die gelbe Farbe und das dunkle Lumen erkennbar sind. C. Werden Hepatozyten aus B. in ein konventionelles zweidimensionales Kultursystem eingebracht, geht die polarisierte, durch Gallenkanalikuli gekennzeichnete Struktur innerhalb von nur 24h verloren. Dieser Prozess ist reversibel. In Abhängigkeit von definierten Kulturbedingungen können Hepatozyten zwischen einem polarisierten (B) und einem nicht-polarisierten Zustand hin- und hergeschaltet werden. D. Ras und TGF-beta führen zur Dedifferenzierung von Hepatozyten. Links oben sind differenzierte Hepatozyten zu sehen, welche zwischen den Zellen Gallenkanalikuli ausbilden. Sowohl durch die Transduktion eines konstitutiv aktiven Ras (rechts oben) als auch durch Exposition gegenüber TGF-beta (links unten) geht die polarisierte Struktur verloren. Die Zellen dedifferenzieren und bilden Stressfasern aus.

Abb. 2: Der differenzierte Zustand von Hepatozyten in vitro wird besonders durch den MAP Kinase und den PI-3K/Akt Signaltransduktionsweg beeinflusst. Überaktivierung der MAP Kinase Signaltransduktion führt zu morphologischer Dedifferenzierung mit Eigenschaften der epithelialen-zu-mesenchymalen Transition (EMT). Hingegen führt Überaktivierung von PI-3K/Akt zu Apoptoseresistenz (Godoy et al., 2009). Durch Kontrolle dieses Signaltransduktionsnetzwerks können in vitro in vivo ähnliche Eigenschaften erreicht werden.

Video 1: Dieses Video zeigt den dynamischen Prozess, wie kultivierte Hepatozyten Gallenkanälchen ausbilden. Die Gallenkanälchen durchlaufen anfangs einen dynamischen Prozess, während dessen sich das Lumen der Kanälchen pulsierend ändert und sehr große Durchmesser annehmen kann. Nach Etablierung des Kanälchens zeigen diese charakteristische kleineren Lumina und konstantere Durchmesser.

Weitere Videos mit Hepatozyten, auch in Interaktion mit Endothelzellen und Tumorzellen finden sie hier.

Neue Systeme zur Testung von Neurotoxizität

Gemeinsam mit der Projektgruppe von Christoph van Thriel und dem ISAS (Dr. Jonathan West) entwickeln wir Screeningtechniken für neurotoxische Substanzen, welche die Ausbildung neuronaler Vernetzungen hemmen (gefördert im Rahmen des EU-Projekts ESNATS). Ein längerfristiges Ziel dieser Arbeiten besteht darin, die in vitro Systeme mit Neuronen (auch aus Stammzellen abgeleitete Neurone) mit den oben aufgeführten in vitro Systemen mit Hepatozyten zusammenzuführen. Hierdurch soll es ermöglicht werden, eine Neurotoxizitätstestung mit und ohne hepatischen Metabolismus durchzuführen.

Abb. 3: Das Prinzip des neuen Testsystems besteht darin, dass mittels Mikroprinting erreicht wird, dass die Zellkörper von Neuronen (grün) sich nur an definierten Positionen eines Zellkulturchips ansiedeln können. Anschließend bilden sie Neuritenverbindungen zwischen den Zellkörpern aus (rot). Diese können automatisiert gezählt werden. Bestimmte neurotoxische Substanzen wie zum Beispiel Acrylamid hemmen die Ausbildung dieser Neuritenverbindungen. Diese Hemmung der neuronalen Vernetzung findet bei Konzentrationen statt, welche weit unter dem zytotoxischen Bereich liegen.

Video 2: Die Ausbildung von Neuritenverbindungen zwischen Neuronen stellt einen dynamischen Prozess dar. Dieses spezielle Beispiel zeigt, dass nach Ausbildung der Vernetzungen die Neuritenfasern sogar von neuronalen Zellkörpern zur Wanderung zwischen zwei Anheftungsfoci genutzt werden können.

Ausgewählte Publikationen

Godoy P, Hengstler JG, Ilkavets I, Meyer C, Bachmann A, Müller A, Tuschl G, Mueller SO, Dooley S. Extracellular matrix modulates sensitivity of hepatocytes to fibroblastoid dedifferentiation and transforming growth factor beta-induced apoptosis. Hepatology. 2009 Jun;49(6):2031-43.

Brulport M, Schormann W, Bauer A, Hermes M, Elsner C, Hammersen FJ, Beerheide W, Spitkovsky D, Härtig W, Nussler A, Horn LC, Edelmann J, Pelz-Ackermann O, Petersen J, Kamprad M, von Mach M, Lupp A, Zulewski H, Hengstler JG: Fate of extrahepatic human stem and precursor cells after transplantation into mouse livers. Hepatology 2007;46:861-70.

Hewitt NJ, Lechon MJ, Houston JB, Hallifax D, Brown HS, Maurel P, Kenna JG, Gustavsson L, Lohmann C, Skonberg C, Guillouzo A, Tuschl G, Li AP, LeCluyse E, Groothuis GM, Hengstler JG. Primary hepatocytes: current understanding of the regulation of metabolic enzymes and transporter proteins, and pharmaceutical practice for the use of hepatocytes in metabolism, enzyme induction, transporter, clearance, and hepatotoxicity studies. Drug Metab Rev 2007;39:159-234.

Hengstler JG, Utesch D, Steinberg P, Ringel M, Swales N, Biefang K, Platt KL, Diener B, Böttger T, Fischer T, Oesch F, Cryopreserved primary hepatocytes as an in vitro model for the evaluation of drug metabolism and enzyme induction. Drug Metab Rev 32, 81-118, 2000.

Aurich H, Sgodda M, Kaltwaßer P, Vetter M, Weise A, Liehr T, Brulport M, Hengstler JG, Dollinger MM, Fleig WE, Christ B. Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from human adipose tissue in vitro promotes hepatic integration in vivo. GUT 2009;58:570-81.

Aurich I, Mueller LP, Aurich H, Luetzkendorf J, Tisljar K, Dollinger M, Schormann W, Walldorf J, Hengstler J, Fleig WE, Christ B. Functional integration of human mesenchymal stem cell-derived hepatocytes into mouse livers. Gut. 2007;56(3):405-415.

Ruhnke M, Ungefroren H, Nussler A, Martin F, Brulport M, Schormann W, Hengstler JG, Klapper W, Ulrichs K, Hutchinson JA, Soria B, Parwaresch RM, Heeckt P, Kremer B, Fändrich F, Reprogramming of Human Peripheral Blood Monocytes into Functional Hepatocyte and Pancreatic Islet-like Cells. Gastroenterology, 128:1774-86, 2005.

Weng HL, Liu Y, Chen JL, Huang T, Xu LJ, Godoy P, Hu JH, Zhou C, Stickel F, Marx A, Bohle RM, Zimmer V, Lammert F, Mueller S, Gigou M, Samuel D, Mertens PR, Singer MV, Seitz HK, Dooley S. The etiology of liver damage imparts cytokines transforming growth factor beta1 or interleukin-13 as driving forces in fibrogenesis. Hepatology. 2009 Jul;50(1):230-43.

Dooley S, Hamzavi J, Ciuclan L, Godoy P, Ilkavets I, Ehnert S, Ueberham E, Gebhardt R, Kanzler S, Geier A, Breitkopf K, Weng H, Mertens PR. Hepatocyte-specific Smad7 expression attenuates TGF-beta-mediated fibrogenesis and protects against liver damage. Gastroenterology. 2008 Aug;135(2):642-59.

• In vitro Systeme mit Hepatozyten, Methodenentwicklung der Toxitätstestung
• Räumlich-zeitliche Modellierung von Gewebetoxizität und Regeneration
• Karzinogenese und Tumorentwicklung
• Konzeptuelle und methodische Innovationen für die Anwendung und Regulation